|
|
Mikrobiyolojik Tanı Yöntemleri pH Tayini Amin Koku Testi Whiff Testi Bakteriyel Vaginitis | Jinekolog Op. Dr Filiz Tosun Çataklı
MİKROBİYOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ
Vagina ve servikal infeksiyonlar,genital infeksiyonlar arasında önemli bir bölüm oluştururlar. Vaginitislerin en sık nedenleri bakteriler, mantarlar, trikomonas vaginalis, gonokoklar, klamidya, mikoplazma ve herpes genitalisdir.
Genital muayene,özellikle vulva ve interlabial sekresyonların incelenmesi ile başlar. Spekulum muayenesinde vagina ve serviksin klinik değerlendirilmesinden başka,arka fornikste biriken akıntıdan bir örnek alınır. Bu akıntı örneği renk,koku ve akışkanlık açısından değerlendirilir . Ayrıca,bu örnekte pH tayini ve KOH (potasyum hidroksid ) ile amin koku testi (Whiff testi) yapılır. pH tayininin amacı vaginanın infeksiyonlara bağlı olarak bozulan pH’sını saptamaktır. pH saptanması için Nitrazin testi (turnusol kağıdında renk değişikliği oluşması ) uygulanır. Amin testi için akıntıdan alınan bir damla üzerine %10’luk KOH damlatılır.
Nonspesifik vaginitiste, aneorob mikroorganizmaların metobolizması sonucu oluşan aminler, KOH eklenmesi ile alkali hale gelen ortamda,çevreye çürümüş balık kokusunun yayılmasına neden olurlar. Daha sonra,akıntıdan alınan bir damla örnek ile serum fizyolojik ve %10 KOH karıştırılarak üzerine lamel konur ve 2 adet taze preparat hazırlanır. Bu sırada,lamel ve serum fizyolojik oda sıcaklığında olmalıdır. Serum fizyolojikle hazırlanan preparatla Gardrenella vaginalis ( Hemofilis vaginalis) vaginitislerinde görülebilen "Clue" (anahtar) hücreleri 400x büyütme altında aranır. Bu hücrelere gram boyama ya da PAP smear prepartlarında da rastlanabilir. Bundan başka,trikomonas vaginitisinde,serum fizyolojikle hazırlanan prepartlarda,bu mikroorganizma %60-70 oranında hareketli veya hareketsiz olarak görülebilir.
KOH, ortamında mantar hiflerinin filamantöz ve spor biçimleri daha rahat görünür hale gelir. Spekulum muayenesinde, infeksiyonun servikal kaynaklı olduğu düşünülürse,endoserviks ve Skene bezlerinin ağızlarından alınan akıntı örneği Gram boyanarak preparatlar yapılır. Preparatta Gram (-) diplokokların görülmesi N.gonorea tanısını düşündürmelidir. Ancak sadece gram boyama ile bu mikroorganizmanın tanısı kesin değildir. Gerek görülürse,endoserviksden veya servikal akıntıdan gonokok için kültür yapılabilir. Aynı şekilde bu teknik klamidya infeksiyonları için de geçerlidir. Kültür örneği uygun bir besiyerine ekilerek (stuart,amies) laboratuara gönderilmelidir.
BAKTERİYEL VAGİNİTİS
Erişkin kadınlarda vagina florası laktobasillerin (Döderlein basilleri ) hakimiyetindedir. Florada %50-80 oranında görülürler. Bundan başka,bu ortamda bulunan mikroorganizmalar S.epidermidis,Grup B,D streptokoklar ve anaerob mikroorganizmalardan bakteriodes türleridir. Vagina epiteli laktobasiller tarafından laktik aside çevrilen glikojenden zengindir. Glikojenin laktik aside çevrilmesi nedeniyle,vagina pH’ı asittir.(3,85,5).
Bu durum patojen mikroorganizmaların çoğalmasını engeller. Vaginada doğal defansın ortadan kalktığı prepübertal ve postmenopozik dönemler veya immün supresyon oluşturan durumlarda,normal floranın bozulup yerine karışık anaerob mikroorganizmaların hakim olmasıyla bakteriyel vaginitis tablosu oluşur. Bu durumda vagina pH 4,7’nin üzerindedir ve amin koku testi pozitiftir. Gram boyama yapıldığında etken mikroorganizmada artış ile birlikte laktobasiller çok azalmıştır. Bu durum mikroorganizmaların neden olduğu aktif klinik infeksiyonlar için geçerlidir. Bu durumda klinik olarak değerlendirme yapılmalıdır. Vaginal kültürün özel durumlar dışında yararı yoktur. Kültürde görülen mikroorganizmaların bir çoğu, E.coli ya da Gardnerella gibi normal vagina florasında görülmektedir.
TRİKOMONAS VAGİNİTİS (TRİCHOMONAS VAGİNALİS)
Serum fizyolojik ile hazırlanan preparatın mikroskop altında incelenmesi ile hareketli trikomonasların görülmesiyle tanı konur. Çok sayıda polimorf nükleer lökosit mevcuttur. Bakteriyel flora değişmiştir. Amin testi nadiren pozitif olur. Trikomonas kültürü pratikte uygulanmaz. Örneklerin laboratuara kadar ulaştırılması sırasında genellikle trikomonaslar öldüğünden tanısı hasta başında konulmalıdır.
MANTAR İNFEKSİYONLARI
Erişkin kadınlar mantar infeksiyonunun klinik belirtilerini göstermeden de taşıyıcı olabilmektedir. Mantarlar ( Candida albicans ),% 17-70 oranında normal florada da bulunur. Florasında mantar bulunan kadınlarda hücreler az sayıdadır ve filamantöz şekilde olmazlar. Direkt mikroskopik incelemede KOH ile hazırlanan preparatlarda mantar hücrelerinin filamantöz formlarının görüldüğü hastalarda mantar infeksiyonu düşünülmelidir. Mantar infeksiyonlarında pH 4.5'dan küçüktür ve amin testi negatiftir.
GONOKOK İNFEKSİYONU
N.gonorrhoeae tanısında kullanılan klasik yöntemlere birçok yeni yöntem eklenmiştir. Doğrudan gram boyası ile tanıda duyarlılık endoserviks için %30-60'dır. Vagina için hiç önerilmemiştir. ThayerMartin,MartinLewis,NYC gibi kültür ortamlarına yapılan direkt ekimlerde duyarlılık endoserviks için %8595;vagina için %50-85 olarak saptanmıştır. Yani örneğin alınması gereken yer endoserviksdir,ayrıca direkt gram boyama tek başına yetersizdir,bu nedenle kültür yukarıda bahsedilen selektif ortamlara doğrudan ekimle yapılmalıdır.
Örneğin doktor muayenehanesinden laboratuara taşınması sırasında bakteri yaşamını yitirmektedir. Ancak karbonodioksitli ortamda özel taşıma ve kültür sistemlerinde (Transgrow, lembecUSA) ki bunlar çok pahalıdır,örnek başarı ile laboratuara ulaştırılabilir. Ayrıca taşıma öncesi preinkübasyon gereklidir. Ülkemiz şartlarında başarılı bir sonuç için endoserviksten alınan örnek,laboratuarın göndereceği kültür ortamına hasta başına ekilip 37C de laboratuara taşınmalıdır ya da örnek laboratuarda alınmalıdır. Diğer Neisseria türlerinden özel yöntemlerle ayrılmalıdır.
KLAMİDYA İNFEKSİYONLARI
Klamidya infeksiyonlarının tanısında gold standart McCoy hücrelerine (McCoy hücreleri laboratuarda üretilen bir insan epitel hücre türüdür ve deney için kullanılır ) meteryalin ekilmesi yolu ile yapılan hücre kültür yöntemidir. Örneğin alınması ve taşınması çok kritiktir.
1. Örnek alınmadan normal steril swab (eküvyon çubuğu ) ile endoserviks iyice silinmelidir (Bu swab N.gonorrhoaea için değerlendirilebilir ).
2. Örnek vagina duvarına değmeden dakron swab ile alınmalıdır. Özel fırça ile epitel hücreleri daha iyi aldığından tercih edilebilir.
3. Swab 0.2 molar sukroz içeren fosfat tamponuna alınır ya da serum içeren hücre kültürü ortamına kırılarak konur. Bu ortamlar mutlaka antibiyotik içermelidir. Örnek alınır alınmaz +4 C de laboratuara taşınmalıdır.
Kültür olanağı olmayan laboratuarlar için floresanantikor yönteminde ya da EIA yöntemleri kullanılabilmektedir. Yayma preparatını Papanicolau ile boyayarak inkluzyon cisimciği bakma değersiz bir yöntemdir. Florasanantikor yönteminde yayma preparatın üzerine C.Trachomatis için FITC (FITC=Floresan veren bir kimyasal madde ) ile işaretli spesifik monoklonal antikor eklenir. Floresan madde (FITC) ile monoklonal antikorun bağlanması ile mikroskopta epitel hücrelerin içerisinde yaygın yeşil floresan veren noktalar görüldüğünde sonuç pozitif olarak değerlendirilir.
Yanlış negatifleri oldukça az bir yöntem olmakla beraber yanlış pozitifi olabilen bir yöntemdir. EIA floresanantikor yönteminde olduğu gibi yanlış negatif ve pozitifleri olan bir testtir. Yanlış negatifleri daha sık olmakla birlikte floresan mikroskopisi olmayan laboratuarlar için tekrarlanılabilen sonuçlar verdiği için avantajlıdır.
FRENGİ SİFİLİZ İNFEKSİYONU
Frengi etkeni olan Treponema pallidumun kültürü kolaylıkla ve ucuz bir şekilde yapılamamaktadır.Tanıda kullanılan yöntemler karanlık saha mikroskopisinden,serolojik çalışmalar ve PCR ‘a (polymerase chain reaction) kadar uzanmaktadır. Treponema pallidum ışık mikroskobunda izlenemeyecek kadar incedir. Özel bir mercek sistemi olan karanlık saha mikroskobunda hareketli olarak izlemek mümkündür. Bu teknik sadece şankr,kondiloma lata yada mukoz plaklardan alınacak örnekler için uygundur. Patojen olmayan treponemaların testi yanlış çıkarabildiği iyi bilinmektedir. Direkt floresan antikor yöntemi ile bu tür yanlış pozitifler ortadan kaldırılabilmektedir.
Bu tür direkt yöntemlerin lezyona bağlı olduğu sekonder sifilizde ve özellikle daha ileri evrelerde işe yaramayacağı açıktır. Frengi tanısında en yaygın yöntem serolojik testlerdir. Serolojik testler treponemal olmayan ve treponemal testler olmak üzere iki temel grupta ele alınacaktır.
a) Treponemal olmayan testler (nontreponemal):
En sık uygulanan yöntemler VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) ve RPR (Rapid Plasma Reagin) adı verilen flokülasyon ve aglütinasyon testleridir. Sifiliz hastalarının çoğunda nontreponemal serolojik testler erken primer sifilizde yani lezyonun görülmeye başladığı 47 gün sonra pozitif olmaya başlar. Herşeye rağmen primer sifilizde nontreponemal testlerde %13 ile %41 hastada negatif çıkabilir. Bu nedenle testin reaksiyon vermemesi yani nonreaktif olması hastalığın her zaman olmaması anlamına gelmemektedir. Sadece çok yüksek antikor titrasyonlarında prozone reaksiyonu olmakta ve test negatif sonuç vermektedir.
Serumun sulandırılması ile prozone*reaksiyonunun önüne geçilebilir. Bu olay bütün immünolojik testlerde görülebilir. Antikor titrasyonu genellikle ya sekonder ya da erken latent evrede en yüksek düzeylerine erişmektedir ve bazen hasta tedavi edilmese dahi hastalığın ilerlemesi ile antikor düzeyleri azalmaya başlamakta ve nonreaktif olabilmektedir. Tedavi ile hastaların büyük çoğunluğunda 3 ile 12 ayda sözünü ettiğimiz nontreponemal antikorlar nonreaktif olmakta ve ancak çok az kısmında düşük titrasyonda pozitif sonuçlar izlenmektedir. Bu nontreponemal serolojik testler birçok nedenle de rahatlıkla yanlış pozitif sonuçlar verebilmektedir.
Bunlar;pnömokok pnömoniler,bakteriyel endokardit,şankroid,kızıl,malarya,tüberküloz,lepra,riketziyosisler,mikoplazma pnömonisi , lenfogranüloma venerum ,psitakkozis, tripaanosomiyazis ,borelyozisler, leptospirozis,çiçek ya da aşılama,kızamık,suçiçeği,infeksiyöz mononükleoz,viral hepatit,gebelik,intravenöz uyuşturucu alan kişiler,mültipl miyelom,birden fazla kan transfüzyonu,ilerlemiş kanser hastalarıdır. Bu testlerin pozitif çıktığı durumlarda treponemal testlere geçilmelidir.
b) Treponemal testler:
TPI(T.pallidum immobilizasyon) testi bir treponemal serolojik testtir,yani treponema palliduma spesifiktir. Bu test spesifik olmakla beraber duyarlılığı az ve çalışması zordur. En çok kullanılan ve duyarlılığı yüksek olan test FTAABS(FloresanTreponemal Antikor Absorbsiyon ) testidir.
Treponemal testler primer sifilizi olan hastaların %20’sinde nonreaktif kalabilmelerine rağmen,nontreponemal testlerden daha az yanlış negatifliğe sahiptirler,o testlerden daha çabuk pozitif olurlar ve üstelik daha spesifiktirler. FTAABS gibi gelişmiş treponemal testlerin çok sık kullanılmamasının nedeni her laboratuarda uygulanamaması ve testin pahalı oluşudur. Treponemal testlerin yanlış pozitif sonuç verdiği durumlar az olmakla beraber yinede mümkündür. Bunlar;Lyme hastalığı,lepra,malarya,infeksiyöz mononükleöz,leptospirozis,relapsing fever ve sistemik lupustur.
GENİTAL HERPES SİMPLEKS İNFEKSİYONLARI
Virüs kültürü vezikül ve püstüllerden alınan örneklerden yapıldığında %90 doğru sonuç vermektedir. Kabuk tutmuş lezyonlarda başarısı %30’dur. Birinci hecmede lezyonun başlamasından sonra ilk 7 günde nüks gösteren herpetik lezyonlarda 2 gün içinde örnek alınmalıdır. Örnek dacron swab ile alınıp özel viral taşıma ortamlarına alınmalı ve soğukta saklanarak laboratuara soğukta gitmesi sağlanmalıdır. Her ne kadar HSV’nin ( herpes simpleks virüs ) laboratuar tanısında gold standart virüs kültürü ise de uygulayan laboratuarların az oluşu nedeni ile direkt floresan antikor ya da ELISA yöntemleri ile antijen tayini daha sık başvurulan yöntemler olmuştur. Kültüre oranla duyarlılığı %70 ila %90 arasında değişmektedir. Serolojik testler yine ELISA ya da indirekt floresan antikor yöntemleri ile yapılmaktadır. HSV Tip 1 ile HSVTip 2’yi ayırmak yani genital HSV antikorlarını spesifik olarak saptamak önemlidir. Herşeye rağmen antikor saptanması:
1 Geçirilmiş HSV enfeksiyonunu ortaya koymakta,
2 Serokonversiyonu yani HSVIgM antikorlarının yok oluşu ve HSVIgG antikorlarının ortaya çıkmasını görmekte işe yaramaktadır. Ayrıca hastanın cinsel temasla ilk kez bulaştığını sandığı HSV2 lezyonu daha önce alınmış herhengibir serumda bakılan HSV2 antikoru ile doğrulanabilir. Bunu yazmadaki amacımız bazen birinci HSV2 yani genital herpes infeksiyonu asemptomatik geçirilebilmekte ve hasta bunu anlayamamaktadır. Herhangi bir rekürrens öncesi cinsel temasta seksüel partner kolaylıkla hasta tarafından suçlanabilmektedir.
HUMAN PAPİLLOMA VİRÜS (HPV ) İNFEKSİYONLARI
Varolan laboratuar tanı yöntemi sadece DNAhibridizasyon yöntemidir. Serolojik tanı için uygulama yoktur. Biyopsi matreyallerinde çalışma mümkündür.DNA hibridizasyon yöntemleri içinde in situ hibridizasyon en çok kullanılan yöntemdir .Bu yöntem spesifik olmakla beraber duyarlı değillerdir. Nedeni test sonucunun hasta materyalinden elde edilebilecek DNA ve onun içerdiği HPV DNA’sının miktarına bağlı oluşudur. Yanlışnegatifliği azaltmak için PCR*(Polymerase Chain Reaction) yöntemi ile HPV DNA’sı binlerce ve hatta gerekirse milyonlarca kez çoğaltılabilir.
Böylelikle kolayca saptanabilecek konsantrasyonlara ulaşılabilmektedir
PCR,DNA polimeraz denilen enzim kullanılarak virüslerin DNA’sının başlangıç DNA'larının verilmesi ile yeniden virüs DNA’sının tüpte yapılabilmesini sağlamaktır. Virüs tanısı dışında da biyokimyasal araştırmalarda adli tıbba kadar çok çeşitli uygulamalar vardır. Günümüzde bu sayede bakteri,prozotoa ve mantarların da tanısı konulabilmektedir.
Sayfa Başı
|